Radiojodowane pochodne nimesulidu w obrazowaniu COX-2

Cyklooksygenaza-2 (COX-2) to indukowalny enzym odpowiedzialny za syntezę prostaglandyn, odgrywający kluczową rolę w procesach zapalnych, bólowych i gorączkowych. W warunkach fizjologicznych COX-2 występuje w niskich stężeniach, ale ulega znaczącej ekspresji pod wpływem cytokin i czynników wzrostu. Konstytutywnie obecny jest w mózgu i nerkach, gdzie wspiera plastyczność synaptyczną, pamięć i regulację przepływu krwi mózgowej. W chorobach neurodegeneracyjnych – takich jak choroba Alzheimera czy Parkinsona – nadekspresja COX-2 promuje stan zapalny, stres oksydacyjny i śmierć neuronów. Enzym ten powiązano również z ostrymi stanami patologicznymi, w tym hipoksją, niedokrwieniem i napadami padaczkowymi.

Ze względu na swoje zróżnicowane i krytyczne funkcje, COX-2 stanowi ważny cel terapeutyczny w ośrodkowym układzie nerwowym. Molekularne metody obrazowania – zwłaszcza znakowane izotopowo sondy do pozytonowej tomografii emisyjnej (PET) i tomografii emisyjnej pojedynczych fotonów (SPECT) – oferują cenne narzędzia do oceny aktywności COX-2 in vivo. Takie obrazowanie może wspomóc ocenę neuroinflammacji i zajętości receptorów docelowych przez leki, jednak pozostają istotne wyzwania: penetracja bariery krew-mózg (BBB), stabilność metaboliczna i selektywność względem COX-1 to główne przeszkody w zastosowaniu klinicznym.

Nimesulid – selektywny względem COX-2 niesteroidowy lek przeciwzapalny (NLPZ) – przyciągnął uwagę jako szczególnie obiecująca struktura do tworzenia sond molekularnych ze względu na wysoką selektywność wobec COX-2 i korzystne cechy strukturalne. Badania kliniczne wykazały, że nimesulid hamuje aktywność COX-2 przy minimalnym wpływie na COX-1, a modelowanie molekularne ujawniło subtelne różnice w miejscach aktywnych izoform COX. Pochodne oparte na szkielecie nimesulidu rozwijano w celu zwiększenia selektywności COX-2 lub nadania dodatkowych właściwości, takich jak aktywność przeciwnowotworowa, co podkreśla strukturalną wszechstronność tej cząsteczki.

Dlaczego dotychczasowe podejścia nie sprawdziły się?

W poprzednich badaniach zespół zaprojektował i zsyntetyzował pochodne nimesulidu z grupą metoksylową jako kandydatów na znaczniki COX-2 dla mózgu. Pochodna para-metoksy-nimesulidu, znakowana węglem-11 w pozycji metoksylowej, wykazała umiarkowaną selektywną aktywność hamującą COX-2 (IC₅₀ = 2,31 µM) i generowała niewielki, ale istotny specyficzny sygnał in vivo. Autoradiografia ex vivo ujawniła niejednorodną dystrybucję w mózgu, prawdopodobnie związaną z COX-2, wskazując na wiązanie specyficzne dla regionu. Krytycznie jednak wychwyt w mózgu myszy był niski, co sugerowało ograniczoną penetrację BBB, a związek był szybko metabolizowany in vivo.

Te odkrycia uwydatniły kluczowe wyzwania dla rozwoju znaczników COX-2 ukierunkowanych na mózg: istotną potrzebę poprawy specyficznego wiązania do COX-2, zwiększenia penetracji mózgowej i wzrostu stabilności metabolicznej. Obecne badanie skupiło się na pochodnych nimesulidu, w których wprowadzono jod w pozycji meta lub para pierścienia benzenowego (związki 1b i 1c) jako bezpośrednią strategię przezwyciężenia wcześniej obserwowanych ograniczeń.

Jak przeprowadzono badanie i jakie metody zastosowano?

Badanie przeprowadziło kompleksową ocenę radioizotopowych pochodnych nimesulidu [¹²⁵I]1b i [¹²⁵I]1c w modelach mysich. Syntezę rozpoczęto od przygotowania pochodnych tributylocynowych 2b i 2c poprzez stannylację odpowiednich związków jodowanych 1b i 1c. Radioznakowanie jodem-125 przeprowadzono metodą chloraminy-T, osiągając wydajność radiochemiczną 83,9 ± 7% dla [¹²⁵I]1b i 79,1 ± 14% dla [¹²⁵I]1c, przy czystości radiochemicznej >99% w obu przypadkach.

Badania in vivo przeprowadzono na samcach myszy BALB/cCrSlc (7–10 tygodni) w dwóch głównych modelach: normalnym i zapalnym. Model zapalenia wywoływano przez podskórne wszczepianie dysku papierowego nasączonego terpentyną w udo prawej tylnej nogi, 7 dni przed podaniem znacznika. Biodystrybucję oceniano w punktach czasowych: 30 min, 1, 2, 6, 12 i 24 h po iniekcji dożylnej, z wielkościami próbek n=4–10 w zależności od punktu czasowego.

Autoradiografię ex vivo wykonano na skrawkach koronalnych mózgu (grubość 10 µm) na czterech poziomach względem bregma. Badanie dopełniono barwieniem hematoksyliną-eozyną oraz immunohistochemiczną oceną ekspresji COX-2 przy użyciu specyficznego przeciwciała poliklonalnego. Analizę metabolitów przeprowadzono metodą HPLC po ekstrakcji z osocza, mózgu i tkanki zapalnej. Wiązanie z białkami osocza oceniano in vitro przy użyciu urządzeń ultrafiltracyjnych Centrifree i Amicon, z wykorzystaniem [¹⁴C]diazepamu i [¹⁴C]antypiryny jako kontroli.

Co wykazały szczegółowe analizy biodystrybucji?

W mózgu normalnych myszy radioaktywność [¹²⁵I]1b osiągnęła maksimum 1,16 %ID/g po 2 h od podania, podczas gdy [¹²⁵I]1c osiągnął szczyt 1,38 %ID/g po 1 h. Kluczowo jednak w obu przypadkach wychwyt mózgowy był niższy niż we krwi i mięśniach. Radioaktywność [¹²⁵I]1b utrzymywała się we krwi przez wydłużony okres, wykazując wysoką retencję nawet 24 h po podaniu (7,82 ± 1,2 %ID/g), podczas gdy [¹²⁵I]1c wykazywał wysoką akumulację we krwi 30 min po iniekcji, następnie zależny od czasu klirens.

Akumulacja w tarczycy wyraźnie różniła się między izomerami. Dla [¹²⁵I]1b wynosiła 0,09 %ID/g po 30 min i 0,10 %ID/g po 24 h, nie wykazując istotnych zmian w czasie. Natomiast dla [¹²⁵I]1c wzrosła znacząco z 0,10 %ID/g po 2 h do 0,49 %ID/g po 24 h, sugerując dejodynację in vivo. Autoradiografia ex vivo wykazała jednolity rozkład [¹²⁵I]1b w całym mózgu, bez specyficznych struktur neuronalnych, a obszary wyższej intensywności odpowiadały regionom zawierającym krew. Podanie wraz z inhibitorami COX (indometacyna lub celekoksyb) nie zmieniło rozkładu radioaktywności, wskazując na brak specyficznego, blokowalnego wiązania.

W modelu zapalenia wychwyt radioaktywności [¹²⁵I]1b w regionie zapalnym wzrastał w czasie, osiągając szczyt 7,54 ± 1,6 %ID/g po 6 h, następnie stopniowo spadając do 24 h. Stosunek zapalenie/krew wzrósł z 0,42 ± 0,1 po 30 min do 0,60 ± 0,1 po 6 h. Co istotne, w badaniu blokującym przeprowadzonym po 6 h wychwyt [¹²⁵I]1b w regionie zapalnym nie został istotnie zredukowany przez żaden z inhibitorów COX w porównaniu z kontrolą. Jednak stosunek zapalenie/mięsień został istotnie zmniejszony przez nimesulid (2,05 ± 0,6 vs 3,12 ± 0,5 w kontroli, p<0,05) i celekoksyb (1,76 ± 0,5 vs 3,12 ± 0,5, p<0,05), wskazując na bardziej złożoną interakcję w tkankach obwodowych.

Jaką rolę odgrywa wiązanie z białkami osocza?

Badanie wiązania z białkami ujawniło, że [¹²⁵I]1b wiąże się wyjątkowo silnie z białkami osocza: 99,9% w ludzkim osoczu, mysim osoczu i ludzkiej albuminie oraz 76,5% w ludzkiej α1-glikoproteinie kwaśnej. Dla porównania [¹⁴C]diazepam (kontrola pozytywna o wysokim wiązaniu) wykazał wiązanie 99,0% w ludzkim osoczu i albuminie, 93,6% w mysim osoczu i 50,2% w α1-glikoproteinie kwaśnej. [¹⁴C]antypiryna (kontrola negatywna o niskim wiązaniu) wykazała 32–44% wiązania w osoczu i albuminie oraz tylko 1,5% w α1-glikoproteinie kwaśnej.

Albumina odgrywa kluczową rolę w dostarczaniu leków in vivo. Dla skutecznego przejścia przez BBB leki muszą być w stanie niezwiązanym lub wolnym, a nie związanym z białkami osocza. Chociaż wiele czynników – w tym lipofilowość, masa cząsteczkowa i powinowactwo do transporterów – przyczynia się do penetracji BBB, nadmierne wiązanie albuminy zmniejsza wolną frakcję związku i ma tendencję do tłumienia wychwytu mózgowego. Ograniczona penetracja mózgowa obserwowana dla [¹²⁵I]1b jest zatem w dużej mierze przypisywana jego wysokiemu stopniowi wiązania z białkami osocza.

W kontekście dystrybucji w tkankach obwodowych kilka badań nad rozwojem radioaktywnie znakowanych znaczników obrazujących guzy wykazało korelacje między wiązaniem albuminy osocza a dystrybucją w tkankach. Badania te konsekwentnie wskazują, że wysokie wiązanie albuminy ma tendencję do zwiększania poziomów tła we krwi i spowalniania klirensu krwi, prowadząc do niższych wskaźników guz/krew we wczesnych punktach czasowych po iniekcji. Z czasem jednak utrzymująca się retencja w guzie skutkuje stopniowym wzrostem stosunku guz/krew. Co ważne, wyższe wiązanie albuminy niekoniecznie przekłada się na korzystniejszą dystrybucję w tkankach; raczej optymalny i odwracalny stopień wiązania albuminy – często na poziomie pośrednim – wydaje się preferowany.

Co determinuje stabilność metaboliczną pochodnych nimesulidu?

Różnice w stabilności metabolicznej obserwowane między wcześniej opisaną pochodną [¹¹C]metoksy-nimesulidu a obecnymi pochodnymi [¹²⁵I]jodo-nimesulidu sugerują, że właściwości elektronowe podstawników mogą wpływać na ich los metaboliczny. Podobne trendy były zgłaszane w poprzednich badaniach. Na przykład N-dealkilacja para-podstawionych N,N-dimetyloanilin zależy od charakteru elektronoakceptorowego lub elektronodonorowego podstawników, co z kolei wpływa na szybkość reakcji. Podobnie para-podstawione azobenzeny z grupami elektronodonorowymi promowały zarówno wiązanie CYP, jak i reakcje redukcji w mikrosomach wątrobowych szczura.

Te odkrycia wspierają pogląd, że wprowadzenie podstawników elektronodonorowych w pozycji para pierścienia benzenowego ma tendencję do zwiększania metabolizmu za pośrednictwem CYP, podczas gdy podstawniki elektronoakceptorowe go tłumią. Biorąc pod uwagę, że jod jest podstawnikiem elektronoakceptorowym, podczas gdy metoksy jest grupą elektronodonorową, te odkrycia wspierają pogląd, że elektronodonorowy lub elektronoakceptorowy charakter podstawników przyczynia się do stabilności metabolicznej pochodnych nimesulidu obserwowanej w tym badaniu. Być może najbardziej znaczącym postępem koncepcyjnym z tego badania jest wykazanie, że stabilność metaboliczna szkieletu nimesulidu może być racjonalnie modulowana przez właściwości elektronowe jego podstawników.

Jakie są ograniczenia i przyszłe kierunki badań?

Badanie ma kilka ograniczeń, które należy wziąć pod uwagę. Po pierwsze, chociaż ocena wykorzystywała pojedynczy model zapalenia, stanowi silną podstawę dla przyszłych badań. Kolejnym logicznym krokiem będzie ocena [¹²⁵I]1b w innych modelach zapalenia obwodowego, takich jak zapalenie stawów lub zapalna choroba jelit, gdzie COX-2 jest kluczowym czynnikiem patologicznym. Po drugie, chociaż oceniono stabilność metaboliczną radiośledzików, nie przeprowadzono szczegółowej identyfikacji wszystkich potencjalnych metabolitów, pozostawiając niepewność co do kompletnych szlaków metabolicznych. Po trzecie, obecne odkrycia opierają się na eksperymentach przedklinicznych, a bezpośrednia ekstrapolacja na ludzkie obrazowanie COX-2 powinna być dokonywana z ostrożnością.

Immunohistochemiczne barwienie wykazało, że ekspresja COX-2 w mózgach myszy BALB/cCrSlc była stosunkowo niska, sugerując, że poziom ekspresji mógł być niewystarczający do odpowiedniej oceny przydatności [¹²⁵I]1b jako znacznika COX-2. Faktycznie badanie opublikowane w 2025 roku porównywało wychwyt [¹¹C]MC1 między myszami ekspresjonującymi zhumanizowany COX-2 (hCOX-2) a myszami typu dzikiego i wykazało, że myszy typu dzikiego wykazały minimalny wychwyt. Dlatego dalsza ocena w modelach o wyższej ekspresji COX-2 może być wymagana do ostatecznego określenia jego potencjału do obrazowania mózgu.

Niemniej jednak ograniczenia te nie umniejszają ogólnego znaczenia wyników, które dostarczają ważnych spostrzeżeń na temat wpływu właściwości elektronowych podstawników na los metaboliczny pochodnych nimesulidu. Przyszłe badania z większymi grupami pacjentów, alternatywnymi modelami zwierzęcymi i rozszerzonymi analizami metabolicznymi będą niezbędne do dalszej walidacji i rozszerzenia tych odkryć.

Czy radiojodowane pochodne nimesulidu mają przyszłość w obrazowaniu molekularnym?

W wysiłku zmierzenia się z potrzebą ulepszonych znaczników COX-2 zsyntetyzowano i oceniono radiojodowane pochodne nimesulidu z celem opracowania znaczników COX-2 ukierunkowanych na mózg. [¹²⁵I]1b wykazał wysoką czystość radiochemiczną i niezwykłą stabilność metaboliczną, a jego selektywną akumulację w miejscach zapalenia potwierdzono w modelu mysim. W przeciwieństwie do tego nie zaobserwowano wyraźnej specyficznej dla COX-2 akumulacji w mózgu, a silne wiązanie z albuminą osocza sugerowano jako jeden z czynników ograniczających wychwyt mózgowy. Odkrycia te wskazują, że chociaż [¹²⁵I]1b ma obecnie ograniczony potencjał jako znacznik ukierunkowany na mózg, może nadal być obiecującym radiośledziem do wizualizacji ekspresji COX-2 w tkankach obwodowych – co samo w sobie jest ważnym zastosowaniem. Co więcej, badanie wykazało, że właściwości elektronowe podstawników mają wyraźny wpływ na stabilność metaboliczną, dostarczając ważnych spostrzeżeń, które mogą bezpośrednio informować o przyszłym projektowaniu znaczników obrazujących.